Конспект Методы клеточной биологии. Микроскопия

Световая микроскопия

Световой микроскоп – прибор для рассмотрения объектов.  Он представляет собой оптическую систему, состоящую из следующих элементов:

  • Конденсатор
  • Объектив
  • Окуляр

Принцип работы светового микроскопа

Пучок света от источника освещения собирается в конденсаторе и направляется на объект. Прошедшие сквозь объект лучи света попадают в систему линз объектива. Таким образом строится первичное изображение, которое увеличивается линзами окуляра.

Объектив является главным элементом оптической системы микроскопа, который определяет возможности прибора. В современных микроскопах используются сменные объективы, позволяющие изучать клетки при разной степени увеличения.
Важнейшая характеристика микроскопа – разрешающая способность. Разрешающая способность объектива –это минимальное расстояние между двумя точками, которые видны раздельно; вычисляется по формуле:

методы клеточной биологии

λ – длина волны света, используемого для освещения объекта, n – коэффициент преломления среды, α – угол между оптической осью объектива и наиболее отклоняющимся лучом, попадающим в объектив.

Из формулы следует:

  • чем меньше длина волны, тем выше разрешение (тем меньшего размера объект можно увидеть)
  • чем выше нумерическая апертура объектива (n⋅sin α), тем выше разрешение

При использовании источников освещения в видимой области спектра (400-700 нм), максимальное разрешение микроскопа не превышает 200-350 нм (0,2-0,35 мкм).

При использовании источников освещения ультрафиолетовой области спектра (260-280 нм), максимальное разрешение микроскопа не превышает 130-140 нм (0,13-0,14 мкм), что является пределом теоретического разрешения светового микроскопа, которое определяется волновой природой света.

Таким образом, световой микроскоп увеличивает разрешающую способность глаза в 1000 раз (разрешающая способность невооруженного глаза приблизительно 0,1 мм).

Метод «темного поля» (ультрамикроскопия)

Метод ультрамикроскопии позволяет увидеть объекты величиной менее 0,2 мкм. Метод основан на эффекте Тиндаля: при боковом освещении в клетке светятся мельчайшие частицы, от которых отраженный свет попадает в объектив микроскопа. Ультрамикроскопия успешно используется для изучения живых клеток.

Метод фазово-контрастной микроскопии

Большинство компонентов клетки мало отличаются по коэффициентам преломления и поглощения от среды (вода, тканевый раствор) и друг от друга, поэтому они мало контрастны и плохо различимы при рассмотрении клетки в проходящем свете. Для исследования клеточных структур меняют освещенность, жертвуя четкостью изображения, а также используют специальные приборы и методы.

Среди этих методов – фазово-контрастная микроскопия. Метод основан на различии (хоть и небольшом) в плотности и светопреломлении клеточных компонентов. Свет, проходя сквозь них, изменяет фазу, что неуловимо человеческим глазом, так как глаз чувствителен только к изменению интенсивности. Изменение фазы преобразовывается в изменение интенсивности (яркости), зависящей от амплитуды волны. В объектив фазово-контрастного микроскопа встроена специальная пластинка, проходя через которую луч света испытывает дополнительный сдвиг фазы колебаний. При построении изображения происходит взаимодействие лучей, находящихся в одной фазе либо в противофазе, но обладающих разной амплитудой. Таким образом, создается светло-темное контрастное изображение объекта.

Интерференционная микроскопия

В интерференционном микроскопе пучок параллельных световых лучей от источника разделяется на два потока: один проходит через объект и меняет фазу колебания, другой идет мимо объекта. В объективе два потока соединяются и интерферируют между собой. В результате интерференции образуется изображение, на котором компоненты клетки в зависимости от плотности имеют разную контрастность.

Поляризационная микроскопия

Поляризационный микроскоп позволяет исследовать объекты, обладающие изотропией – упорядоченной ориентацией субмикроскопических частиц (миофибриллы, волокна веретена деления). В оптическую систему такого микроскопа входят поляризатор и анализатор, представляющие собой призмы, которые пропускают световые волны с определенной плоскостью поляризации. Помещенный между призмами объект, который обладает двойным лучепреломлением, будет виден как светящийся на темном поле.

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия – это метод изучения структур, которые находятся вне пределов видимости светового микроскопа (размеры объектов меньше 1 мк).

В отличие от свтеового микроскопа, в электронном вместо светового луча используется поток электроннов, а вместо линз – магниты (магнитные линзы).

Различные участки объекта по-разному задерживают электроны, и на экране электронного микроскопа образуется черно-белое изображение объекта, увеличенное в сотни тысяч раз.

Теги:

Рубрики:

Биология

Просмотры: 236

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *