Хроматография

Краткая теория по хроматографии

Задачи, решаемые с помощью хроматографии:

• очистка веществ от примесей
• концентрирование веществ и выделение их из разбавленных растворов или смесей
• качественный и количественный анализ смесей веществ
• разделение смеси веществ на отдельные компоненты
• установление индивидуальности вещества
• идентификация веществ

Суть метода

Метод хроматографии основан на различной способности компонентов смеси распределяться между двумя несмешивающимися фазами – подвижной и неподвижной.
Неподвижная фаза (НФ):

• Твердое вещество
• Жидкость
• Смесь твердого вещества и жидкости

Подвижная фаза (ПФ, элюент) – пропускается через НФ или течет по ней:

• Жидкость
• Газ

В зависимости от своей природы вещества перемещаются потоком подвижной фазы по неподвижной с разной скоростью, которая обусловлена силой взаимодействия вещества с фазами.
Взаимодействие вещества с НФ определяется адсорбцией (прочность связывания), абсорбцией, хемосорбцией и другими процессами. НФ может действовать по принципу молекулярного сита, «просеивая» молекулы по форме и размеру.
Взаимодействие веществ с ПФ определяется различной растворимостью в ней. Из-за сродства вещества к НФ, его скорость меньше скорости ПФ.
Фазы для хроматографического разделения выбирают так, чтобы коэффициенты распределения компонентов смеси в них были различными.
Элюат — раствор, содержащий растворенные вещества смеси. Выходит из слоя НФ.

Разновидности хроматографии

По агрегатному состоянию ПФ:

• Газовая
• Жидкостная

По сорбционному действию НФ:

• Адсорбционная. НФ – твердые вещества с развитой поверхностью и активными центрами, способными к обратимому взаимодействию с молекулами разделяемой смеси.

• Распределительная (абсорбционная). НФ – неподвижно закрепленная жидкость на пористом инертном носителе, несмешивающаяся с подвижной фазой (газ или жидкость). Разделение происходит за счет многократно повторенных актов экстракции.

• Ионообменная. НФ – ионнообменная смола, ПФ – электролит. Разделение компонентов смеси основано на установлении ионнообменного равновесия между фазами.

• Ситовая

Разделение сложных смесей веществ с разными молекулярными массами. Гели с заданной пористостью удерживают молекулы определенного размера и формы, а крупные молекулы вымываются в порядке уменьшения молекулярной массы. НФ – растворитель внутри пор геля. ПФ – растворитель, перемещающийся вдоль зерен геля.

ПФ	НФ	Хроматографический метода	Аппаратурное оформление
Газ	Жидкость	Газо-жидкостная	Колоночная
	Твердый адсорбент	Газо-адсорбционная	Колоночная
Жидкость	Жидкость	Жидкостно-жидкостная (распределительная, абсорбционная)	Бумажная, тонкослойная, колоночная
	Твердый адсорбент	Жидкостно-адсорбционная	Тонкослойная, колоночная
	Ионообменная смола	Ионообменная	Колоночная
	Гели, молекулярные сита	Гель-фильтрация, ситовая	Колоночная

Жидкостно-адсорбционная хроматография

В процессе хроматографирования происходит сорбция (удерживание веществ адсорбентом) и десорбция (вытеснение подвижной фазой адсорбированных частиц).

Требования к НФ (адсорбент):

• не взаимодействует с разделяемыми веществами и растворителем
• избирательный – обладает как можно большим различием в адсорбируемости веществ разделяемой смеси
• обладает максимальной поглотительной способностью

Классификация адсорбентов:

• полярные (гидрофильные): оксид алюминия, силикагель, гипс, цеолиты, целлюлоза.
• неполярные (гидрофобные): активированные угли, графитовая сажа.

Адсорбционная способность

-СН=СН-< -ОСН₃< -СООR< C=О< -СНО< -SH< -NH₂< -OH< -COOH

Адсорбционное сродство полярных веществ к полярным адсорбентам значительно выше, чем у неполярных.
Оксид алюминия Al₂O₃ – адсорбент амфотерного характера. На его поверхности имеется несколько типов активных адсорбционных центров. Одни из них избирательно сорбируют кислоты, другие – основания. На нем можно разделять различные смеси как в полярных, так и в неполярных растворителях.

Активность оксида алюминия зависит от содержания в нем влаги. Не содержащий влаги Al2O3 имеет самую высокую активность и условно принимается за единицу. Оксид алюминия с необходимой активностью можно приготовить, смешивая свежепрокаленный оксид с необходимым количеством воды (по шкале Брокмана):

Активность Al2O3	I	II	III	IV	V		Активность силикагеля	I	II	III	IV	V
Количество воды, %	0	3	6	10	15		Количество воды, %	0	10	12	15	20

Силикагель – высушенный желатинообразный диоксид кремния, который получают из силиката натрия. Благодаря своей высокой пористости обладает значительно большей сорбционной емкостью, чем Al₂O₃. Благодаря кислым свойствам своей поверхности (рН 3–5) достаточно прочно сорбирует основания. Поэтому на силикагеле основания, как правило, не хроматографируют.

Характеристика элюента (ПФ)

Способность элюента вытеснять адсорбированные на активных центрах молекулы исследуемых веществ (десорбция) зависит от полярности элюента.

Элюирующая способность для полярных адсорбентов

н-алканы<циклоалканы<CCl₄< бензол< CHCl₃< диэтиловый эфир< ацетон< EtOAc< EtOH< CH₃COOH< H₂O

Элюирующая способность для неполярных адсорбентов

Лабораторная работа «Хроматография»

Цель работы:

• Колоночная хроматография

а) научиться готовить хроматографическую колонку для разделения смеси веществ
б) разделить смесь окрашенных веществ на фракции

• Тонкослойная хроматография в незакрепленном слое сорбента (Al₂O₃)

а) научиться готовить пластинку с сорбентом
б) определить активность Al₂O₃ по Брокману

• Тонкослойная хроматография в закрепленном слое сорбента

а) подобрать систему растворителей для разделения смеси 2,4-ДНФГ карбонильных соединений
б) разделить и идентифицировать смесь 2,4-ДНФГ карбонильных соединений

Колоночная хроматография.  Разделение органических веществ на колонке с оксидом алюминия или силикагелем

Подготовка хроматографической колонки

Стеклянные колонки диаметром 8–10 мм и емкостью 25–30 мл или бюретки — перед сборкой тщательно моют, сушат, помещают в нижнюю часть тампон из стеклянной или обычной ваты. Закрепляют в штативе так, чтобы под колонкой мог поместиться приемник (коническая колба емкостью 25–30 мл или штатив с пробирками).

Оксид алюминия массой 4–6 г просеивают через сито с размером отверстий 0,25 мм или через сложенный втрое капроновый чулок, помещают в стакан и взмучивают в том растворителе (10–15 мл), который в дальнейшем будет применяться при разделении смеси веществ. Полученную суспензию сорбента небольшими порциями вливают в закрепленную в штативе колонку.

Когда колонка будет наполнена, с верхней части ее стенок оставшийся сорбент смывают тем же растворителем. Верхний слой сорбента должен быть достаточно ровным и плотным, иначе движущийся фронт веществ при разделении будет сильно искажен. Чтобы колонка заполнялась равномерно, по ней постукивают стеклянной палочкой, на которую натянута резиновая трубка. Когда сорбент окончательно осядет, в верхнюю часть колонки на 0,5 см выше поверхности сорбента помещают второй ватный тампон или кружок фильтровальной бумаги – для предохранения сорбента от взмучивания при последующем внесении в колонку растворов разделяемых веществ и растворителя.

Растворитель должен вытекать из колонки со скоростью 30–40 капель в минуту. Если слой сорбента получится слишком плотным и нужная скорость не будет достигнута, ее увеличивают давлением воздуха на верхнюю часть колонки. Для этого можно использовать резиновую грушу.

Смеси разделяемых веществ и растворители для элюирования

Смеси веществ	Растворитель для заполнения колонки и вытеснения 1 фракции	Растворитель для вытеснения 2 фракции
Азобензол – о-нитроанилин	Тетрахлорметан	Эфир
о-Нитроанилин – эозин	Ацетон – вода, 1:1	Вода
Малахитовый зеленый – эозин	Ацетон – вода, 1:1	Вода
о-Нитроанилин – флуоресцеин	Ацетон – вода, 1:1	Вода
Метилоранж – малахитовый зеленый	Ацетон – вода, 1:1	Вода
Метилоранж – кристаллический фиолетовый	Ацетон – вода, 1:1	Вода

Хроматографическое разделение смеси окрашенных веществ

Когда уровень растворителя в колонке опустится до верхнего тампона ваты, в колонку приливают заранее приготовленный раствор смеси веществ в минимальном количестве растворителя. Во время работы сорбент всегда должен быть покрыт растворителем, иначе в сорбенте образуются воздушные пробки и вымывание зон становится неравномерным.

Остатки раствора разделяемой смеси смывают со стенок колонки небольшим количеством растворителя. Когда уровень раствора опустится до верхнего тампона, осторожно добавляют растворитель (элюент) порциями по 2–3 мл. При промывании колонки растворителем, вытесняют окрашенные зоны в приемники. Для вымывания всех зон можно изменять полярность растворителя. В данной работе для вытеснения второго красителя следует использовать другой растворитель.  Если делят смесь бесцветных веществ, то собирают в пробирки небольшие по объему (по 10–20 мл) фракции прошедшей через колонку жидкости (элюата). Затем при помощи тонкослойной хроматографии определяют в каждой фракции наличие или отсутствие вещества.

Тонкослойная хроматография (ТСХ) в незакрепленном слое сорбента. Определение активности Al₂O₃ по Брокману

Подготовка пластинки с незакрепленным слоем сорбента

Для хроматографии в тонких слоях обычно используют оксид алюминия или силикагель. Оксид алюминия просеивают через сито с размером отверстий 0,25 мм или капроновый чулок, сложенный в три слоя.

В держатель вставляют тщательно вымытую и высушенную стеклянную пластинку размером 9 х 12 см, насыпают на нее просеянный сорбент и выравнивают слой с помощью специального валика или стеклянной палочки, на концы которой надеты кольца из резиновой трубки. При выравнивании слоя сорбента валик необходимо тянуть, а не катить. Слой сорбента не должен доходить до левого и правого краев пластинки на 0,5–1,0 см.

На пластинке на расстоянии 1 см от ее нижнего края помечают линию нанесения вещества (линию старта) с помощью тонкой нити или волоса, стараясь не нарушить слой сорбента. На линию старта с помощью специального капилляра наносят растворы веществ на расстоянии 1,0–1,5 см друг от друга и от края пластинки. Каждое вещество (смесь) наносят отдельным капилляром, слегка касаясь слоя сорбента, чтобы его не нарушить. Диаметр пятна нанесенного вещества должен быть не более 2–3 мм. Если нанесено мало вещества (маленькое пятно), то при хроматографировании получатся плохо видимые пятна, а если много, то получатся чересчур большие и плохой формы пятна, которые могут сливаться с пятнами соседних проб, имеющих близкую длину пробега.
После испарения растворителя пластинку с нанесенными пробами помещают в наклонном положении в специальную кювету (хроматографическую камеру), на дно которой наливают растворитель или смесь растворителей («систему»). Стартовая линия должна быть выше уровня растворителя (системы) на 3–5 мм, в противном случае нанесенные вещества смоет в кювету с растворителем. Растворитель начинает подниматься по пластинке за счет капиллярных сил. Фронт растворителя должен быть горизонтальным. Если растворитель поднимается не горизонтально, то пластинку сразу же вынимают из камеры, дают высохнуть и снова помещают в камеру, отрегулировав горизонтальный подъем растворителя смещением камеры. После установки пластинки камеру закрывают крышкой для предохранения растворителя от испарения.

Через крышку хроматографической камеры наблюдают за продвижением растворителя по пластинке. После того как фронт растворителя поднимется почти до края пластинки (0,5 см до края), ее вынимают из камеры, слегка постукивают по ней, чтобы отметить положение фронта растворителя, и высушивают в вытяжном шкафу. Если хроматографируют неокрашенные вещества, то после высушивания проявляют пятна, помещая пластинку в эксикатор с иодом или рассматривая ее при УФ освещении.

Затем измеряют расстояние от линии старта до линии финиша (У –длина пробега растворителя) и расстояние от линии старта до середины пятна (Х – длина пробега пятна вещества). Определяют фактор замедления R_f (читается эр эф): R_f = Х/У. Величина R_f всегда меньше 1 и зависит от следующих основных факторов:

• степени сродства вещества к сорбенту
• свойства сорбента
• природы элюента

Определение активности Al₂O₃ по Брокману

Краситель	Активность по Брокману
	II	III	IV	V
Азобензол	0,59	0,74	0,85	0,95
п-Метоксиазобензол	0,16	0,49	0,69	0,89
Судан желтый	0,01	0,25	0,57	0,78
Судан красный	0,001	0,1	0,33	0,56
п-Аминоазобензол	0,000	0,03	0,08	0,19

При определении активности оксида алюминия используются растворы стандартных красителей в ССl₄. Для этих красителей известны значения R_f на оксиде алюминия разной степени активности в ССl₄.
На приготовленную пластинку наносятся растворы красителей как описано выше. Хроматографирование проводят в четыреххлористом углероде. Пластинку высушивают в вытяжном шкафу. Для каждого красителя рассчитывают значение R_f и сравнивают эти значения с табличными данными.

Тонкослойная хроматография в закрепленном слое сорбента. Разделение и идентификация смеси 2,4-динитрофенилгидразонов (ДНФГ) карбонильных соединений

2,4-ДНФГ карбонильных соединений интенсивно окрашены в желтый или красный цвет и видны на пластинках без дополнительного проявления. Поэтому 2,4-ДНФГ часто используются для идентификации карбонильных соединений методом ТСХ.

Подбор системы растворителей

При выполнении работы студент получает задачу (смесь 2,4-ДНФГ, состоящую из 2–3 веществ) и набор индивидуальных 2,4-ДНФГ («свидетели»), которые могут входить в состав задачи. Вещества растворяют в хлороформе (или хлористом метилене), каждое вещество в отдельной склянке.

Берут пластинку размером 5 х 6 см и простым карандашом аккуратно, стараясь не повредить слой сорбента, намечают линию старта. Линия старта должна находиться на расстоянии 0,5–0,7 см от нижнего края пластинки. На этой линии помечают точки нанесения вещества, которые должны располагаться на расстоянии 0,5–0,8 см друг от друга и от края пластинки. Затем в эти точки наносят растворы веществ. Причем в центре наносят задачу, а по краям «свидетели». Вещества наносят тонким капилляром, слегка касаясь поверхности пластинки. Диаметр пятна не должен превышать 2 мм.

После этого экспериментально подбирают систему растворителей, в которой смесь 2,4-ДНФГ будет четко разделяться, а пятна веществ (большая часть) на хроматограмме располагаться в районе значений R_f 0,4–0,8. В качестве элюента используют смесь гексана (петролейного эфира) и этилацетата (серного эфира), соотношение растворителей устанавливают опытным путем, постепенно увеличивая полярность системы.

При подборе системы растворителей в хроматографическую камеру вначале наливают 3–5 мл неполярного растворителя (гексана или петролейного эфира), помещают в камеру пластинку и наблюдают, поднимаются пятна на хроматограмме или нет. Если пятна веществ не поднимаются, то пластинку вынимают из камеры и высушивают. А в камеру добавляют 0,5 – 1,0 мл полярного растворителя (этилацетат или диэтиловый эфир) и снова повторяют хроматографирование. Повторив несколько раз такую операцию, находят приблизительное соотношение растворителей в системе. Затем в мерном цилиндре готовят свежую систему растворителей и хроматографируют в ней вновь подготовленную пластинку с 2,4-ДНФГ. При малых и близких значениях R_f хроматографирование одной и той же пластинки можно повторить два или три раза в той же системе. Перед повторным хроматографированием пластинку необходимо высушивать. Пятна веществ на хроматограмме должны быть правильной формы (круглые или слегка вытянутые) и хорошо видны. Если пятно плохо видно, необходимо увеличить концентрацию вещества на пластинке. Для этого в одну и ту же точку наносят вещество несколько раз. Если пятно вещества имеет «хвост», необходимо уменьшить концентрацию вещества. Для этого разбавляют приготовленный раствор вещества.

Идентификация 2,4-ДНФГ

После хроматографирования сравнивают значения R_f соединений смеси и свидетелей и делают вывод о составе анализируемой смеси. При необходимости повторяют хроматографирование в подобранной системе, исключив свидетели, которые заведомо не входят в состав смеси.